Antiflammin-1抑制博来霉素诱导的肺纤维化及其机制研究

【摘要】肺纤维化是严重危害健康的呼吸系统常见并发症,是各种不同病因的肺间质疾病的最后共同结局。由于大部分肺部疾病的最终转归都伴有不同程度的肺纤维化,因此肺纤维化不仅是肺部疾病转归的结果,还是导致原有疾病进一步恶化的主要原因。目前肺纤维化的临床治疗以给予皮质类固醇类和其他免疫抑制剂药物为主,但是研究发现其只对部分肺纤维化患者有效,对特发性肺纤维化患者疗效较差。肺纤维化的发病率和死亡率近年呈逐渐上升态势,对人类健康危害极大。因此,寻找新的治疗策略迫在眉睫。Antiflammin-1(AF-1)是与子宫珠蛋白(uteroglobin,UG)第三个alpha螺旋中的保守序列高度同源的一段寡肽,由于最初发现在体内具有较强的抗炎作用而得名。AF-1由九肽组成,对应于UG分子中的第39～47位氨基酸(MQMKKVLDS)。研究证实,AF-1具有抗炎、抑制细胞趋化及粘附等多种与UG相似的生物活性。与大分子天然蛋白UG相比较,AF-1的分子量更小,免疫原性更低,因此具有潜在的应用前景。以往的研究集中在对AF-1的抗炎作用和机制的探索上,鉴于UG在肺纤维化发生发展中的重要作用和本课题组前期关于AF-1抑制转化生长因子betal(transforminggrowthfactor-betal,TGF-β1)诱导的NIH3T3增殖的作用,本课题首先在整体实验部分探索AF-1是否具有抑制博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠急性肺炎症反应和抗肺纤维化的作用。我们在前期实验中发现,UG的活性片段AF-1也能够特异性地结合UG受体,并且通过UG受体的介导,AF-1能够特异性的调节小鼠成纤维细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号途径。由于UG受体同样表达于肺泡上皮细胞上,那么,既然AF-1能够通过结合成纤维细胞膜上的UG受体而抑制TGF-β1促增殖的作用。那么是否AF-1同样能通过上皮细胞膜上的UG受体而发挥某种生物学功能?本课题进一步在细胞实验部分尝试观察：①AF-11是否能够抑制TGF-β1诱导的上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的作用?②如果能,是否同样依赖于UG受体的介导?第一章AF-1抑制博来霉素诱导的急性肺损伤方法：将60只实验小鼠随机分为3组,A组为生理盐水组,B组为BLM组,C组为BLM+AF-1组。单次给予小鼠气管内注射BLM(5mg/kg)以造成小鼠急性肺损伤,每日腹腔注射AF-1(2mg/kg),于BLM给药7天后收集样本,检测肺湿干重比值,HE染色法观察小鼠肺组织病理形态学变化,ELISA法检测肺组织匀浆TGF-β1、白介素-1beta(interleukin-1β,IL-1β)及肿瘤坏死因子-alpha(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-a)的浓度,肺组织匀浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性的检测,肺泡灌洗液中细胞分类计数、蛋白含量及乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)活性的检测。结果：(1)气管内注射BLM(5mg/kg)后第7天,BLM组肺湿干重比值、肺系数及MPO活性较正常对照组显著增加(P<0.05),给予AF-1(2mg/kg)处理后,BLM+AF-1组肺湿干重比值及肺系数明显下降(P<0.05),肺组织匀浆液中MPO活性下降,说明AF-1处理后可抑制BLM肺所致组织水肿和中性粒细胞的渗出。(2)BLM组肺泡灌洗液中LDH活性和含量均高于正常对照组(P<0.05),经AF-1处理后,肺泡灌洗液中LDH活性和蛋白含量较BLM组明显下降(P<0.05),说明AF-1处理后可减轻博来霉素所致肺组织的损伤和血浆蛋白的渗出。(3)BLM组肺泡灌洗液中的细胞总数、中性粒细胞的数量和百分比、淋巴细胞的数量和百分比均显著升高(P<0.05)。经AF-1处理后,肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞的数量和百分比、淋巴细胞的数量较单独给予BLM组明显下降(P<0.05),但淋巴细胞的百分比较单独给予BLM组未见显著变化,进一步证实AF-1处理后可减轻BLM所致中性粒细胞和淋巴细胞的渗出。(4)病理切片H&E染色显示,正常小鼠肺泡结构完整,肺泡壁较薄,肺泡内未见炎症细胞浸润。BLM处理后,肺泡间隔显著增厚,部分肺泡结构遭到破坏,大量肺泡塌陷,局部肺泡出现代偿性扩张,肺泡腔内大量炎症细胞聚集。经腹腔注射AF-1(2mg/kg/day)干预后,肺组织炎症病变明显减轻。(5)BLM组小鼠肺组织中细胞因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α的含量与正常对照组相比均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),经AF-1处理后,小鼠肺组织中TGF-β1、IL-1β、TNF-α的水平的显著下降,与单独给予BLM组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：单次给予小鼠气管内注射BLM可引起小鼠急性肺炎症反应性肺损伤,腹腔给予AF-1可有效抑制BLM可引起小鼠急性肺炎症反应性肺损伤。第二章AF-1抑制博来霉素诱导的肺纤维化方法：单次给予小鼠气管内注射BLM(5mg/kg)以制备小鼠肺纤维化模型。于BLM给药的第0、3、7、10、14、21、28天处死小鼠,收集样本,ELISA法检测肺组织匀浆中炎症因子IL-1β.IL-6口TNF-α的动态变化,碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)的含量变化。根据炎症和纤维化反应在不同时期的发生发展过程,制定预防性性给药方案和治疗性给药方案以确定AF-1是否具有直接的抗纤维化作用。预防性给药方案：64只实验小鼠随机分为4组,A组为生理盐水组,B组为AF-1组,C组为BLM组,D组为BLM+AF-1组。从BLM给药后第0天至第27天,每天腹腔注射AF-1(2mg/kg),第28天处死小鼠收集样本。治疗性给药方案：从BLM给药后第11天至第27天,每天腹腔注射AF-1(2或10mg/kg),第28天处死小鼠收集样本。具体检测指标为观察并记录小鼠第28天时体重的变化及每日的存活率,H&E染色及Masson染色法分别观察小鼠肺组织病理形态学改变和胶原纤维分布。碱水解法检测肺组织中HYP的含量来间接反应胶原沉积程度。RT-PCR法检测肺组织中EMT相关基因的mRNA的表达情况。结果：(1)于第0天气管内注入BLM(5mg/kg),分别于给药后的第0、3、7、10、14、28天处死小鼠,收集各时间点肺组织样本。结果显示,IL-1p、IL-6和TNF-a具有相似的动态表达变化。BLM给药后第3天IL-1p、IL-6和TNF-a的表达均较第0天显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。高水平的表达一直持续到第10天,10天后,这三种炎症细胞因子的表达明显下降,并于第14天左右均降到接近正常对照水平。在第14天到第28天的一段时间,表达也未出现明显波动。(2)HYP的含量于前10天未见明显变化,10天后HYP的表达显著升高,第14天BLM组肺组织中HYP的含量较第0天相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。肺组织中HYP的含量于21天达到高峰,21天至28天的一段时间未出现明显波动。(2)给予BLM的小鼠死亡率明显升高,死亡的小鼠大部分集中于前两周。BLM组小鼠体重明显低于对照组(P<0.05)。给予AF-1进行干预后,体重的下降的程度也较BLM组有所减轻(P<0.05)；小鼠的存活率较BLM组也有明显上升。(3)病理切片H&E染色显示,正常小鼠和单纯给予AF-1组小鼠肺组织肺泡结构完整,肺泡壁较薄,无出血等病理改变,而BLM给药28天后,肺组织切片可见大量肺泡萎缩,肺泡腔可见炎症细胞浸润,部分肺泡壁出现增厚,断裂,形成肺大泡。肺间质细胞大量增生。预防性给予AF-1可使BLM组小鼠肺组织纤维化病变出现了明显减轻。(4)病理切片Masson染色显示,胶原纤维被较大分子量的苯胺蓝所染。正常肺组织肺泡结构清晰,完整,被蓝染区域很少。而给予BLM28天后,部分肺泡壁增厚,断裂,肺泡结构被破坏,视野内大部分区域被苯胺蓝染色,说明胶原、纤维连接蛋白等基质大量沉积,预防性给予AF-1可使BLM组小鼠上述病变有所减轻,蓝染区域明显减少。(5)给予BLM后,肺组织HYP的含量和Ashcroftscore评分显著增加,预防性给予AF-1(2mg/kg)干预28天后,肺组织HYP的含量和Ashcroftscore评分较BLM组显著下降,说明预防性给予AF-1处理能够减少BLM诱导的肺组织胶原的沉积。(6)在治疗性给药实验中,我们同样检测了与预防性实验相似的指标,我们发现,于BLM给药后第11天至28天给予小鼠(10mg/kg)的AF-1能够减轻BLM诱导的肺纤维化,而2mg/kg无此作用。结论：单次给予小鼠气管内注射BLM可引起小鼠肺纤维化,腹腔预防性给予AF-1或治疗性给予AF-1均可有效减轻BLM肺纤维化,但治疗性用药所需AF-1的剂量大于预防性用药。第三章AF-1抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化及其机制研究方法：采用TGF-β1诱导的A549上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)模型,在干预组中加入100gM的AF-1,观察AF-1对TGF-β1诱导的A549细胞EMT的影响。于TGF-β1诱导48h后收集细胞,提取总蛋白。在部分实验中分别加入抗UG受体抗体、细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,ERK)通路阻断剂、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK,p38)通路阻断剂、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)通路阻断剂以并进一步研究AF-1的作用机制。Westernblot检测A549细胞中alpha-平滑肌肌动蛋白(a-smoothmuscleactin,a-SMA)口E-钙粘素(E-cadherin)的表达水平。结果：(1)在正常对照组A549细胞的E-cadherin和a-SMA分别呈高表达和低表达,加入TGF-β1后,E-cadherin的表达显著降低,a-SMA表达水平显著增高,而给予AF-1干预后,E-cadherin和a-SMA的表达分别高于和低于TGF-β1组。该结果提示AF-1能够抑制TGF-β1对A549细胞诱导的EMT的转变。(2)为探讨抗UG受体在介导AF-1抑制TGF-p1所致EMT中的作用,本实验室使用抗UG受体的抗体以阻断UG受体。结果显示,加入AF-1前预先给予抗UG受体抗体2小时孵育后再给予AF-1,A549细胞a-SMA的表达较TGF-β1+AF-1组有所升高,而E-cadherin的表达较TGF-β1+AF-1组有所下降。该结果提示AF-1有可能通过UG受体抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT改变。(3)将AF-1作用于A549细胞30分钟,检测细胞内ERK、p38和JNK的磷酸化水平,ERK、p38和JNK的磷酸化水平显著高于对照组,但提前孵育抗UG受体抗体2小时后,ERK、p38和JNK其磷酸化的水平显著下降。说明AF-1通过UG受体诱导ERK,p38和JNK的磷酸化。(4)为探讨MAPK信号通路在介导TGF-β1诱导A549细胞EMT中的作用,我们分别使用了不同MAPK信号通路的阻断剂。结果显示,加入p38通路阻断剂SB203580预处理后,a-SMA的表达较TGF-β1组明显减少,而E-cadherin的表达较TGF-β1组显著增加,说明p38通路在TGF-β1诱导的A549细胞的EMT改变中具有显著作用,在加入JNK通路阻断剂SP600125后,a-SMA的表达较TGF-β1组未见明显变化,而E-cadherin的表达较TGF-β1组出现了明显增加,说明JNK通路在TGF-β1诱导的A549细胞的EMT改变中具有部分作用,而加入ERK通路阻断剂PD98059后,我们发现a-SMA及E-cadherin的表达较TGF-β1组均没有明显改变,说明ERK通路在TGF-β1诱导的A549细胞的EMT改变中不发挥作用。(5)为进一步探讨ERK通路是否参与介导AF-1抑制TGF-β1诱导的A549细胞的EMT变化,我们采用对TGF-β1诱导的EMT无明显作用的ERK通路阻断剂PD98059来研究UG受体下游信号ERK在AF-1抑制TGF-β1诱导的A549细胞的EMT改变中的作用。我们发现,加入AF-1干预后,α-SMA的表达较TGF-p1组显著减弱,E-cadherin的表达较TGF-β1组显著增加,而加入ERK阻断剂PD98059后,AF-1逆转TGF-β1诱导的A549细胞EMT的作用有所减弱,该实验提示ERK信号通路参与了AF-1逆转TGF-β1诱导的A549细胞EMT的作用。结论：AF-1能够抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT转变,该作用有赖于UG受体的介导。AF-1通过UG受体诱导A549细胞ERK、p38和JNK的磷酸化。TGF-β1所致A549细胞EMT转化有赖于p38和JNK信号途径的介导,而与ERK通路无关。但AF-1对TGF-β1诱导EMT的抑制作用需要ERK通路的介导。总结论一、AF-1能够减轻博来霉素诱导的急性炎性肺损伤。二、在博来霉素肺纤维化模型中,腹腔预防性给予AF-1或治疗性给予AF-1均可有效减轻博来霉素肺纤维化,但治疗性用药所需AF-1的剂量大于预防性用药。提示AF-1在体内具有直接的抗纤维化作用。三、AF-1能够通过UG受体抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT改变。四、AF-1通过UG受体激活下游MAPK通路,并且ERK通路参与介导了AF-1对TGF-β1诱导EMT的抑制作用。
【作者】刘伟；
【导师】罗自强；
【作者基本信息】中南大学，生理学，2014，博士
【关键词】antiflammin-1；子宫珠蛋白受体；肺纤维化；上皮间质转化；

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